ディープビジュアルプロテオミクスが単一の定義を定義

Nature Biotechnology volume 40、pages 1231–1240 (2022)この記事を引用

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空間プロテオミクスにはイメージングベースおよび質量分析ベースの方法が利用可能であるにもかかわらず、画像と単一細胞分解能のタンパク質存在量測定を結び付ける重要な課題が依然として残されています。ここでは、人工知能による細胞表現型の画像解析と、自動化された単細胞または単核レーザー顕微解剖および超高感度質量分析を組み合わせたディープビジュアルプロテオミクス (DVP) を紹介します。 DVP は、空間的コンテキストを維持しながら、タンパク質の存在量を複雑な細胞表現型または細胞内表現型に関連付けます。細胞培養物から核を個別に切除することにより、既知の未特徴のタンパク質によって定義されるプロテオミクスプロファイルを使用して、異なる細胞状態を分類しました。アーカイブされた原発性黒色腫組織において、DVP は、正常なメラノサイトが完全浸潤性黒色腫に移行する際の空間的に分解されたプロテオーム変化を特定し、インターフェロンシグナル伝達の低下と一致する転移性垂直増殖における mRNA スプライシング異常など、がんの進行に伴って空間的に変化する経路を明らかにしました。抗原の提示。組織状況における正確な空間プロテオミクス情報を保持する DVP の能力は、臨床サンプルの分子プロファイリングに影響を与えます。

現代の顕微鏡の多用途性、解像度、マルチモーダルな性質により、単一細胞の不均一性と組織組織のより詳細な画像が得られます1。現在、プロテオームの実際の複雑さには遠く及ばない、タンパク質の事前に定義されたサブセットが通常ターゲットとなります。質量分析 (MS) に基づく技術の大幅に向上した感度を利用して、プロテオームの本来の細胞内環境での分析を可能にし、健康と疾患への寄与を調査することに取り組みました。私たちは、サブミクロン解像度のイメージング、人工知能 (AI) に基づく単一細胞の表現型解析のための画像解析、および超高感度プロテオミクスワークフローによる単離を組み合わせました (図 1)。主な課題は、単一細胞の境界と細胞クラスを正確に定義すること、および自動的に定義された特徴を分析の準備が整ったプロテオミクスサンプルに移すことであることが判明しました。この目的を達成するために、走査型顕微鏡とレーザー顕微解剖 (LMD) 顕微鏡を連携させるソフトウェア「BIAS」(Biology Image Analysis Software) を導入します。これにより、細胞培養またはアーカイブされたバイオバンク組織 (ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE)) のデータ豊富なイメージングと、深層学習ベースの細胞セグメンテーションおよび細胞の種類と状態の機械学習ベースの識別がシームレスに組み合わされます。対象となる細胞または細胞内オブジェクトは、AI 単独で、または自動 LMD およびプロテオミクスプロファイリングを受ける前の指示後に選択されます。 DVP によって生成されたデータをマイニングして、完全な空間情報を保持しながら、表現型レベルでのプロテオーム変異に対する分子的洞察を提供するタンパク質シグネチャーを発見することができます。

DVP は、高解像度イメージング、単一細胞の分類と単離のための AI ガイド画像分析を、超高感度プロテオミクスワークフローと組み合わせます2。 DVP は、細胞培養またはアーカイブされた患者バイオバンク組織のデータ豊富なイメージングを、深層学習ベースの細胞セグメンテーションおよび細胞の種類と状態の機械学習ベースの識別と結び付けます。 (非)教師付き AI で分類された細胞または細胞内対象物は、自動 LMD および MS ベースのプロテオミクスプロファイリングを受けます。その後のバイオインフォマティクスデータ分析により、データマイニングによりタンパク質の特徴を発見できるようになり、単一細胞レベルでの健康および疾患状態におけるプロテオームの変動についての分子的洞察が得られます。 tSNE、t 分布確率的近隣埋め込み。

DVP ワークフローの顕微鏡関連の側面は、高解像度のスライド全体のイメージング、画像解析のための機械学習 (ML) およびディープラーニング (DL) に基づいて構築されています。

まず、走査型顕微鏡を使用して高解像度のスライド全体画像を取得し、「BIAS」（方法）と呼ばれる統合画像解析用のソフトウェアスイートを開発しました。 BIAS は、複数の 2 次元 (2D) および 3 次元 (3D) 顕微鏡画像ファイル形式を処理し、主要な顕微鏡ベンダーとデータ形式をサポートします。画像の前処理、DL ベースの画像セグメンテーション、特徴抽出、ML ベースの表現型分類を組み合わせています。細胞質と核のセグメンテーション 3 用の最近の DL ベースのアルゴリズムに基づいて、大規模な画像データセット全体で高品質の画像を維持するための前処理アルゴリズムを実装するためにいくつかの最適化を実施しました。 DL 手法には大規模なトレーニングデータセットが必要ですが、高品質のトレーニングデータのサイズが限られているため、これはかなりの課題です4。この課題に対処するために、nucleAIzer3 を使用し、プロジェクト固有の画像スタイル転送を適用して、実際の画像に似た人工顕微鏡画像を合成しました。このアプローチは本質的に、新しい細胞や組織の種類、染色技術など、さまざまな生物学的シナリオに適応できます5。これらの合成画像を使用してディープニューラルネットワークをトレーニングし、対象の細胞コンパートメント (核や細胞質など、図 2a) を特定します。私たちは、2 つの主要な DL アプローチ (unet4nuclei6 と Cellpose7) と、広く使用されている適応しきい値ベースおよびオブジェクト分割ベースの手法 8 に対してベンチマークを行いました。細胞培養物および組織の細胞および核セグメンテーションアルゴリズムは、最高の精度を示しました（図2b、拡張データ図1a、表1および補足表1）。現在のベンチマーク結果は、追加の方法およびソフトウェア (たとえば、大規模な不均一な顕微鏡画像セットに対する ilastik9) との広範な比較を実行した以前の研究 3 によって裏付けられています。インタラクティブな細胞表現型発見のために、BIAS は教師ありおよび教師なし ML (拡張データ図 1b およびメソッド) に基づいて形態学と近傍の特徴を考慮して表現型の特徴抽出を実行します。特徴に基づく表現型分類は、正確な細胞分類のために抗体染色からのバイオマーカー発現レベルと容易に組み合わせることができます。 ML はこれまで画像解析や細胞選択に使用されてきましたが、不偏プロテオミクスと組み合わせることはありませんでした10。さらに、Python インターフェイスを使用して BIAS を拡張しました。したがって、オープンソースパッケージやカスタムアルゴリズムの統合など、一般的な方法で標準の Python 関数を使用してデータアクセスと操作を行うこともできます。

a、BIAS を使用した、正常に見える細胞と癌細胞および組織の AI による核および細胞質セグメンテーション。 b. F1 メトリックを使用してセグメンテーションアプローチの精度をベンチマークし、結果を 3 つの追加の方法 (M1 はunet4nuclei6、M2 は CellProfiler8、M3 は Cellpose7) と比較しました。一方、OUR は nucleAIzer3 を指します。バーは、標準誤差による平均 F1 スコアを示します。黒色腫組織および (U2OS) 細胞については n = 10 の独立した画像、唾液腺組織については n = 20。セグメンテーション結果の視覚的表現: 緑の領域は真陽性、青は偽陽性、赤は偽陰性に対応します。 c. BIAS は走査型顕微鏡と LMD 顕微鏡の間のインターフェースとして機能し、顕微鏡間での細胞輪郭の高精度な転送を可能にします。対象オブジェクトに対するオフセットの切断と最適なパスの検索の図。 d. 上部パネルの機能の実際的な図。 e、FOXJ1およびEpCAM抗体によるヒト卵管上皮の免疫蛍光染色。それぞれ繊毛細胞と上皮細胞を検出します。左パネル: 繊毛細胞 (FOXJ1 陽性) および分泌細胞 (FOXJ1 陰性)。右パネル: FOXJ1 強度に基づく細胞分類。クラス 1 (FOXJ1 陽性) およびクラス 2 (FOXJ1 陰性)。倍率 = ×387。 f、FOXJ1陽性およびFOXJ1陰性細胞プロテオームのPCA。 g、分泌細胞および繊毛細胞の既知のタンパク質マーカーのヒートマップ。タンパク質レベルは Z スコアで表されます。アスタリスクは代入データを表します。マーカーリストは、Human Protein Atlas20 プロジェクトから派生し、文献マイニングに基づいています。 h、FOXJ1陽性細胞とFOXJ1陰性細胞の間のペアワイズプロテオミクス比較のボルケーノプロット。細胞型特異的マーカータンパク質は緑色と青緑色で強調表示され、黒色は潜在的な新規マーカータンパク質を表します。有意に濃縮された細胞型特異的タンパク質が黒い線の上に表示されます (両側 t 検定、FDR < 0.05、s0 = 0.1、n = 4 生物学的複製)。

BIASで発見された細胞の特徴を物理的に抽出するために、走査型顕微鏡とLMD顕微鏡（現在はZeiss PALM MicroBeam、Leica LMD6およびLMD7）間のインターフェースを開発しました（図2c）。 BIAS は、細胞の輪郭を顕微鏡間で転送し、完全な精度を維持します。 LMD の理論上の精度は、150 倍の対物レンズを使用した場合 70 nm ですが、実際には 200 nm に達しました。最適化後、LMD7 は 1 時間あたり 1,250 個の高解像度輪郭を自律的に切除できます。これはサンプルあたり 50 ～ 100 個の細胞に相当します (方法)。細胞膜への潜在的なレーザー誘発損傷を防ぐために、オフセットを使用して輪郭を切除します（図2c、dおよび補足ビデオ1および2）。

現在の LMD 手法は空間的コンテキストを保存しますが、ほとんどが人間の目で観察可能な表現型に限定されており、細胞を手動で選択する必要があるため、多くの場合、異なる細胞タイプが混合する結果となり、スループットと新規発見が制限されます 11。

DVP ワークフローの感度、特異性、堅牢性を調査するために、細胞系統特異的な転写因子 FOXJ1 を使用して、正常なヒト卵管組織を取得し、分泌細胞 (卵管上皮の 2 つの主要な細胞型 12) から繊毛細胞を分離しました。繊毛機能のマスター調節因子であり、そのプロテオームを測定しました（図2e〜h、拡張データ図1c〜f、補足表2）。 FOXJ1染色細胞ではFOXJ1（繊毛細胞）のみを検出しました（図2e、g）。生物学的複製の優れた相関関係を持つ他の5,000以上の定量タンパク質も検出しました（拡張データ図1d、e）。タンパク質存在量の違いに関するバイオインフォマティクス分析は、異なる細胞タイプの生物学的特徴を反映していました。 (図 2f-h および拡張データ図 1c-f)。これは、繊毛細胞の既知のタンパク質マーカーによって推進され、これらの細胞型とまだ機能的に関連していないタンパク質に拡張されました。我々は、抗体ベースの組織染色と公平な定量的プロテオミクスの組み合わせの重要性を強調するために、例として卵管上皮を使用しました。このような in vivo 細胞型比較により、細胞型および細胞状態マーカーの発見が可能になり、全体的なプロテオームレベルで疾患状態を理解するための公平な情報が提供されます。注目すべきことに、高悪性度漿液性卵巣がんは卵管上皮に由来しており、私たちの方法は現在、無関係な細胞型を混合することなく疾患の早期発症を研究するために適用できます13。

私たちはワークフローを摂動のないがん細胞株に適用し、DVP が一見類似した細胞 (蛍光ユビキチン化ベースの細胞周期指標 (FUCCI) U2OS 細胞 14) 間の機能的不均一性を特徴付けることができるかどうかを判断しました。核および細胞膜検出のためのDLベースのセグメンテーションの後、表現型ごとに80〜100個の単一細胞または250〜300個の核を単離しました（図2c、dおよび3a、b）。 MS による少数の細胞の分析は長年の目標でしたが、微量サンプルの移送、処理、および分析における恐るべき分析上の課題によって妨げられてきました 15。私たちは、超低サンプル入力用に最近開発したワークフロー 2,16 を使用してサンプルを処理しました。これにより、サンプルの移送ステップが省略され、非常に少ない量で確実に脱架橋が行われます（方法）。追加のサンプルの移送やクリーンアップを必要とせずに、384 個のウェルからサンプルを直接分析できることがわかりました。 MS 測定では、新たに開発された質量分析計で追加のイオン移動度次元と最適フラグメント (diaPASEF) イオン回収を備えた並列蓄積 - 連続フラグメンテーションを使用した、データに依存しない取得方法を採用しました 2,17。細胞および核のプロテオームの複製は、高い定量的再現性を示し（ピアソン r = 0.96）、生化学的分離に基づく細胞内プロテオーム実験から予想されるように、細胞全体のプロテオームは核のみのプロテオームとは異なりました18（拡張データ図2a、b）。バイオインフォマティクス濃縮分析では、細胞膜、ミトコンドリア、ヌクレオソーム、転写因子複合体などの用語が非常に重要でした（誤発見率（FDR）< 10-5）（図3c）。

a、DNA (DAPI) で染色した U2OS 細胞の BIAS における細胞全体と核のセグメント化。スケールバー、20 μm b、384 ウェルプレートへの全細胞および核の自動 LMD。画像は採取後のウェルを示しています。 c、細胞全体（n = 3の生物学的複製）と核（n = 3の生物学的複製）特異的プロテオーム間の主要細胞コンパートメントの相対タンパク質レベル（x軸）。 y 軸は点密度を表示します。 d、左：細胞表現型のMLベースの分類のためのBIASの表現型ファインダーモデルの概念的なワークフロー。右: 形態学的特徴と DNA 染色強度に基づいた 6 つの異なる U2OS 核クラスの教師なし ML ベースの分類の結果。色はクラスを表します。スケールバー、20μm。 e、6 つの異なる核クラスを定義するために ML によって使用される表現型の特徴。レーダープロットは、Z スコア付きの形態学的特徴 (核領域、周囲、固体性、および形状因子) および DNA 染色強度 (総 DAPI シグナル) の相対レベルを示します。 f、ML によって識別された 6 つのクラスの核の画像例。青色は DNA 染色強度を、赤色は複製中の細胞を識別するための EdU 染色強度を示します。表示された核は視覚化のために拡大されており、実際のサイズを反映していません。 g、データフィルタリング後の3,653タンパク質グループに基づく5つの間期クラスのPCA。クラスの複製 (n = 3 生物学的複製) は、95% 信頼区間の楕円で強調表示されます。 h. 5 つの核クラス間で制御されるタンパク質の濃縮分析。有意なタンパク質 (515 ANOVA 有意、FDR < 0.05、s0 = 0.1) を、Gene Ontology Biological Process (GOBP)、Reactome 経路、Human Protein Atlas に由来する細胞周期およびがんの注釈に基づいて、未変化のタンパク質のセットと比較しました ( HPA)20. Benjamini-Hochberg FDR 0.05 のフィッシャーの直接確率検定を使用しました (補足表 3)。 i、515 個の ANOVA 有意タンパク質グループすべての教師なし階層クラスタリング (補足表 4)。 HPA によって報告される細胞周期調節タンパク質は下のバーに示されています。核クラス (n = 3 生物学的複製) が横棒に表示されます。 C1 ～ C4 は、さまざまな核クラスで上方制御されたクラスターを示しています。 j、タンパク質クラスター C1 ～ C4 の濃縮された経路のネットワーク分析。パスウェイエンリッチメント分析は、ClusterProfiler R パッケージを使用して実行されました36。 ER、小胞体。 PC、主コンポーネント。

核間の形態学的差異がプロテオームにも反映されているかどうかに対処するために、教師なし表現型ファインダーモデルを使用して、核面積、周囲長、形状因子、固体性、およびDNA染色強度に基づいて形態学的に異なる核のグループを特定しました（図3d）。 MLは3つの主要な核クラス（各27〜37％）を発見し、3つの稀な核クラス（各2〜4％）も特定しました（拡張データ図2c）。結果として得られた6つの異なる核クラスには、サイズと形状に目に見える違いがあり、クラス1は有糸分裂状態を表し、残りの5つのクラスはさまざまな特徴重み付けで間期を表しています（図3e、f）。私たちはその後の分析のために、起源が不明なこれら 5 つの核クラスに焦点を当てました。主成分分析（PCA）では、それぞれのプロテオームの複製が密接にクラスター化し、より頻度の高いクラス（2、3、および5）がグループ化されました（図3g）。この観察を検証し定量化するために、各細胞クラスのプロテオームを視野内のすべての「混合」核のプロテオームと比較しました。これにより、最も希少な細胞クラスは、未分類の「バルク」プロテオームと比較して、差次的に発現されるタンパク質の数が最も多いことが明らかになりました（拡張データ図2d、e）。次に、5つの核クラスにわたるプロテオームの違いが間期状態間の機能的な違いを示唆しているかどうかを尋ねました（図3d、f）。クラス間で有意に差次的に発現された515個のタンパク質は、核および細胞周期関連タンパク質(たとえば、「複製後の状態への起点の切り替え」や「前期染色体の凝縮」など)が豊富であり、細胞周期が機能的なものであることを示唆しています。分離の要因（図 3h–j、拡張データ図 2f、補足表 3 および 4）。私たちのデータを細胞周期調節タンパク質の単一細胞イメージングデータセットと比較すると、調節タンパク質が大幅に豊富であることがわかりました（FDR < 10-6）。同定されたさまざまなクラス間の駆動特徴の1つである核領域は、G1細胞からS / G2細胞への間期に増加し（図3eおよび拡張データ図3a〜c）、核を定義する際の細胞周期の重要性をさらに裏付けています。クラス。

私たちの単細胞型プロテオームは、いくつかの未特徴のタンパク質を発見し、それらを潜在的な細胞機能と関連付ける機会を提供しました。データフィルタリング後に残ったC11orf98、C7orf50、C1orf112およびC19orf53に焦点を当てると（ANOVA P <0.05）、クラス特異的な発現パターンが示されました（拡張データ図3d）。 C7orf50は、クラス2、4、および3の核の核小体で最も高度に発現され、S / G2特異的な特徴を示しました（図3fおよび拡張データ図3d、e）。これは、その発現が細胞周期によって調節されていることを示唆しています。実際、G1期の細胞と比較して、G1/SおよびS/G2ではC7orf50のレベルが高いことを確認しました（拡張データ図3e）。細胞周期調節タンパク質はがんの予後と関連している可能性があるため 19、我々はヒト病理アトラス 20 で C7orf50 を調査し、高発現が膵臓がんの良好な転帰と関連している（拡張データ図 3g; P < 0.001）。バイオインフォマティクス分析により、タンパク質LYAR（「細胞増殖調節核小体タンパク質」）との相互作用、共発現、および共局在が明らかになり、細胞増殖との機能的関連が示唆されました（拡張データ図3f、h）。

クラス6は、既知の細胞周期マーカーとは独立した興味深いプロテオミクス特徴を示しました（図3i、j）。これらの珍しい豆の形をした核は、特定の細胞骨格および細胞接着タンパク質 (VIM、TUBB、ACTB、ITGB1 など) の上方制御を示し、これらのサインが核変形を起こしている遊走細胞に由来することを示唆し、細胞浸潤を示唆しています 21,22。 2D 画像から原子核を分類しましたが、LMD は 3D で原子核を分離することに注意してください。したがって、サンプルでは、クラス 6 核に代表される、核周囲の形態に基づくタンパク質の再局在も調べられます。同様に、核を切除すると、サイトゾルへの、またはサイトゾルからのタンパク質の輸送がある程度捕捉されます。

これらの細胞培養実験は、DVP が細胞の表現型、不均一性、およびダイナミクスを、一般的な表現型とまれな表現型について偏りのない方法でプロテオームレベルと相関させることを確立します。

何十億もの患者サンプルが診断精密検査中に定期的に収集され、世界中の病理部門のアーカイブに保管されています23。組織スライドからの空間的および細胞内状況における単一細胞の正確なプロテオミクス特性評価は、デジタル病理学の新興分野を補完する多大な臨床効果をもたらす可能性があります24。我々は、唾液腺の上皮分泌細胞のまれで研究が十分に進んでいない悪性腫瘍である唾液腺腺房細胞癌の、保存されているパラフィン包埋組織を選択した。我々は、LMD用のガラス膜スライド上での免疫組織化学（IHC）染色プロトコルを開発し、BIASによるセグメンテーションおよび特徴抽出のための細胞境界の輪郭を描くためにEpCAM用に組織を染色した（方法）。これらの組織学的に正常に見える領域は、主に腺房細胞、管細胞および筋上皮細胞で構成されていましたが、癌成分には主に丸い核と豊富な好塩基性細胞質を備えた均一な腫瘍細胞が含まれていました（図4a、b）。

a、細胞接着タンパク質EpCAMを使用した唾液腺腺房細胞癌のIHC染色。ｂ、ａの正常に見える組織（上のパネルＩおよびＩＩ）および腺房細胞癌（下のパネルＩＩＩおよびＩＶ）からの代表的な領域。 c、腺房細胞癌組織に適用された DVP ワークフロー。 EpCAM 陽性の正常に見える細胞 (緑) および腫瘍細胞 (マゼンタ) の DL ベースの単一細胞検出。表現型の特徴 (形状因子、面積、堅固さ、周長および EpCAM 強度) に基づく細胞分類。 d、正常に見える（正常、n = 6）または癌領域（癌、n = 9）からの複製のプロテオーム相関。 e、正常組織と癌組織の間のペアワイズプロテオミクス比較のボルケーノプロット。 t 検定で有意なタンパク質 (両側 t 検定、FDR < 0.05、s0 = 0.1、正常の場合は n = 6 の生物学的複製、癌の場合は n = 9) が黒い線で強調表示されます。正常組織でより高度に発現しているタンパク質は、既知の腺房細胞マーカー (AMY1A、CA6、および PIP) を含め、火山の左側で緑色で強調表示されています。腺房細胞癌でより高度に発現しているタンパク質は右側のマゼンタ色で、これには癌原遺伝子 SRC およびインターフェロン応答タンパク質 (MX1 および HLA-A; 補足表 6) が含まれます。 f、プロテオミクス結果の IHC 検証。 CNN1、SRC、CK5、および FASN は、正常組織または癌組織に著しく濃縮されています。スケールバー、100μm。

疾患特異的なタンパク質の特徴を特定するために、さまざまな割合の無関係な細胞と混合するのではなく、組織学的に正常に見える腺房細胞を悪性細胞と比較することを目的としました。この目的を達成するために、細胞型固有の形態学的特徴に基づいて正常な耳下腺組織の腺房細胞と管細胞を分類し、プロテオーム解析のために単細胞クラスを分離しました（図4cおよび拡張データ図4a）。測定されたプロテオームの差異のバイオインフォマティクス分析により、これらの隣接する細胞型間の重要な生物学的差異が明らかになり、それらの異なる生理学的機能を反映しています。分泌顆粒内で唾液を産生および分泌する腺房細胞は、α-アミラーゼ（AMY1A）、CA6、PIPなどの既知の腺房細胞マーカーとともに、小胞輸送およびグリコシル化に関連するタンパク質の高い発現を示しました（拡張データ図4b）。対照的に、管細胞は、唾液分泌のための高いエネルギー需要を満たすために必要なミトコンドリアと代謝関連タンパク質を高レベルで発現しました25（拡張データ図4cおよび補足表5）。比較のために、同じ組織切片内のさまざまな領域から悪性および良性の腺房細胞のみを切除しました。腺房細胞のプロテオームは疾患状態に関係なくクラスター化しており、起始細胞の強い特徴を示しています（拡張データ図4d）。 6 つの正常に見える複製と 9 つの腫瘍領域を分析すると、優れたグループ内プロテオーム相関関係が示されました (ピアソン r > 0.96)。正常細胞とがん細胞の相関が低いことは、疾患特異的および細胞型特異的なプロテオーム変化を反映していました（ピアソン r = 0.8、図4d、eおよび補足表6）。以前の報告と一致して、癌腫の腺房細胞マーカーは大幅に下方制御されていました 25。 DVP により、インターフェロン応答タンパク質（たとえば、MX1 および HLA-A; 補足表 6）と癌原遺伝子 SRC の上方制御、両方とも実用的な治療標的である 26（図 4e）を発見することができました。我々は、正常に見える組織または癌性組織のいずれかで著しく濃縮されたタンパク質の IHC 分析を使用して、プロテオミクスの所見を検証しました。これにより、CNN1、SRC、CK5、およびFASNが選択され（図4f）、プロテオミクス結果が確認され、汚染がないことが実証され、DVPアプローチの特異性が裏付けられました。

黒色腫の発生と進行における分子変化を解読することは、この高度に転移性の病気の治療上の脆弱性を特定する鍵となります。黒色腫の病原性変異は大部分がカタログ化されている 27,28,29 ため、我々は黒色腫進行の異なる細胞表現型の空間的に分解されたプロテオームを直接研究することに着手した（図5a、bおよび拡張データ図5a、b）。我々は、黒色腫細胞をマッピングするために、17 年間保存された FFPE 包埋原発腫瘍材料を 2 つのマーカー、SOX10 および CD146 で共染色しました。 CD146 の過剰発現は黒色腫の進行に関係しており、CD146 に対する免疫療法は転移を標的としているため 30、我々は分析において疾患進行マーカーとして CD146 を使用しました。 ML は、明確に定義された空間分布を持つ 5 つのクラスを予測しました。クラス 1、上皮内黒色腫。クラス 2、主に腫瘍。クラス 3、腫瘍微小環境の細胞。クラス 4、CD146 高領域が豊富。クラス 5、CD146 低領域が豊富です。私たちはハイコンテンツイメージングを使用して必要な細胞数を決定し、統計的および分析的に堅牢な細胞表現型を特定し、空間領域内で正確な細胞タイプと状態を分離しました。このため、通常、サンプルあたり約 100 個の細胞を収集しました (方法)。複製を含め、同じ組織切片の7つの固有の領域から得られた27の異なるサンプル（正常メラノサイト、原位置黒色腫、放射状および垂直成長期の原発性黒色腫を含む）を単離してプロファイリングしました（図5a〜d）。生物学的複製の間で高い定量的再現性があり、その結果、疾患状態と領域特異的なプロテオームが得られることがわかりました（図5e-g）。前がん性（上皮内黒色腫）と原発性黒色腫は、免疫細胞シグナル伝達と細胞代謝に関与するタンパク質の違いを示し、メラニン生成の減少と一致しました（補足表7および拡張データ図5d）。進行期（放射状および垂直黒色腫増殖期）では、ヒトの癌の既知の特徴である疾患の進行に伴う代謝活性化の明確な活性化が示されました 31。酸化的リン酸化とミトコンドリアの機能に関与するタンパク質の発現は、メラノサイト、上皮内黒色腫、浸潤性黒色腫へと徐々に増加し、進行した腫瘍段階におけるミトコンドリア呼吸への依存性を示しています（図5h〜j、拡張データ図5c、および補足表7〜）。 9)。逆に、抗原提示とインターフェロン反応に関与するタンパク質は、黒色腫における免疫回避戦略と一致して、in situ 黒色腫と比較して下方制御されました（図5h〜jおよび補足表7〜9）。

a、原発性黒色腫のプロファイリングを行うための DVP サンプル分離ワークフロー。 b、DVP を原発性黒色腫に適用し、メラノサイトマーカー SOX10 および黒色腫マーカー CD146 について免疫組織化学的に染色しました。左のパネル: PEN ガラス膜スライド上の染色された黒色腫組織。右のパネル: さまざまな組織領域の病理学に基づいたアノテーション。スケールバー、1 mm。 c、CD146およびSOX10染色強度および空間的局在に基づく病理学者主導のMLベースの細胞分類：正常メラノサイト、間質細胞、上皮内黒色腫、CD146低黒色腫、CD146高黒色腫、放射状増殖黒色腫および垂直成長黒色腫。右下のパネル: 教師なし ML (k-means クラスタリング) によって予測されたクラスの頻度。 d. 7 つの特定されたクラスの写真の例。倍率＝4,400倍。 e、測定された 27 個のプロテオームサンプルすべての相関行列 (Pearson r)。 f、プロテオームの PCA。 g、in situ から浸潤性 (垂直成長) 黒色腫までのすべての黒色腫特異的プロテオームの PCA。 h. 1,910 のすべての ANOVA 有意 (FDR < 0.05) タンパク質グループに基づく教師なし階層クラスタリング。浸潤性黒色腫における上方制御されたタンパク質 (クラスター A) または下方制御されたタンパク質 (クラスター B) の 2 つのクラスターが強調表示されています。 i、プロテオミクス結果を画像データにマッピングする組織ヒートマップ。 2 つのクラスターから選択された用語の相対パスウェイレベルが i で強調表示されます。タンパク質レベルの中央値はアノテーションごとに計算され、セグメント化された細胞輪郭によって定義される x および y 座標に対して、単離された細胞クラスごとにプロットされました。 j、上記iで視覚化した示差的に調節される経路のZスコア付きタンパク質レベルのボックスプロット。箱ひげ図は、データの範囲 (ひげ)、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル (箱)、および中央値 (実線) を定義します。外れ値は、ひげの外側に個々の点としてプロットされます。ｋ、ＣＤ１４６高濃度メラノーマ細胞（クラス４）における垂直方向の増殖（領域２）と放射状の増殖（領域１）のプロテオーム変化を比較する。垂直方向に増殖する黒色腫細胞に近接する血管が赤色で強調表示されます。スケールバー、1 mm。 l、垂直成長期および放射状増殖期の黒色腫細胞の有意に濃縮された経路の遺伝子セット濃縮分析プロット。経路濃縮分析は、垂直黒色腫細胞と放射状黒色腫細胞の間のタンパク質倍率変化に基づいており、ClusterProfiler R パッケージ 36 を使用して実行されました。 FDR < 0.05 の強化された用語が表示されます。 MHC、主要組織適合性複合体。

黒色腫の進行は、放射状および垂直方向の増殖期を含む段階的なプロセスです。同じ表現型（クラス 4 細胞）のこれらの空間的に定義された領域を直接比較すると、細胞外マトリックス（ECM）リモデリング（コラーゲン分解など）や PDGF シグナル伝達の上方制御など、がん転移の重要な特徴がさらに強調されました 33（図 5k、l）。、拡張データ図 5e および補足表 10)。これらの腫瘍による変化は成長をサポートし、腫瘍細胞の遊走を増加させ、隣接する血管を介して離れた臓器への転移を促進するために ECM を再構築します 33。 DVP はまた、放射状成長期と比較して垂直方向での mRNA スプライシングの有意な上方制御も発見しました。発癌促進性の選択的スプライシングは、最近腫瘍学における治療戦略となっており 34、これらの腫瘍はしばしば免疫原性ネオアンチゲンを提示します 35。スプライシングの増加は、免疫関連シグナル伝達（インターフェロンシグナル伝達および抗原提示）の大幅なダウンレギュレーションと一致しており（図5lおよび補足表10）、垂直方向の免疫原性の「ホット」ゾーンから「コールド」腫瘍ゾーンへの移行を示唆しています。同じ腫瘍セクション内の増殖期。明らかに、DVP は、腫瘍関連 mRNA スプライシング、免疫応答、および ECM リモデリング経路を異なる領域に局在化させることにより、腫瘍の不均一性を空間的に解決しました。

DVP は、イメージング技術と不偏プロテオミクスを組み合わせて、特定の細胞内で発現するタンパク質の数を定量化し、組織または細胞型に特異的なプロテオームをマッピングしたり、将来の薬剤や診断のターゲットを特定したりすることができます。私たちは、私たちの分析が豊かな「スライドの中の小宇宙」をどのように描写し、がんの進行において調節不全になっている重要な経路を明らかにし、「デジタル病理学」を分子次元で効果的に拡張するかを示しました。細胞培養から病理まで、顕微鏡で画像化できるあらゆる生物学的システムに広く適用できます。 1 枚のスライドに数十万の細胞を含めることができるため、DVP はまれな細胞の状態と相互作用を発見し、特徴付けることができます。単一細胞トランスクリプトミクスとは対照的に、DVP は ECM の細胞内構造と空間動態を容易に分析できます。プロテオミクス技術のさらなる改良により、DVP は単一細胞型レベルでのプロテオフォームや翻訳後修飾の研究にも適しているはずです。

私たちは、デンマークのロスキレにあるジーランド大学病院病理学部から、唾液腺腺房細胞癌および黒色腫のアーカイブ FFPE 組織サンプルを収集しました。黒色腫組織は 51 歳男性のもので、左胸上部にありました。診断時のTNMステージはT3aN1M0でした。組織学的サブタイプは表在性黒色腫でした。クラークレベルは4でした。ブレスローの厚さは２．２７ｍｍであった。腫瘍免疫浸潤は活発ではないと分類されました。 FFPE サンプルは 17 年前のものでした。患者は診断から 17 か月後に別の場所に再発を経験し、71 か月後に死亡しました。腺房細胞癌は 29 歳男性の右耳下腺から切除されました。有糸分裂、壊死、脱分化、または神経周囲または血管内の成長の兆候はありませんでした。腫瘍細胞は、EpCAM、CK7、DOG1、およびSOX10が陽性でした。マンマグロビンは陰性でした。サンプルは4歳で、現在は無症状です。この研究は、地元の医療倫理審査委員会（SJ-742）およびデータ保護庁（REG-066-2019）の承認のもと、デンマークの法律（人体を対象とする医学研究法）に同意した施設ガイドラインに従って実施されました。。図 2 に示す卵管組織は 64 歳の女性のもので、肉眼的にも組織学的にも正常に見えました。すべての患者は手術前に同意しました。患者由来の組織は、シカゴ大学病院で承認された治験審査委員会プロトコール (13372B) に従って、新鮮な組織またはパラフィン包埋されて入手されました。これらの研究では既存のアーカイブされた病理学的標本が使用されていたため、医療倫理審査委員会の承認に従って、すべての FFPE ヒト患者組織サンプルは同意から免除されました。ヒト組織標本は、認定病理学者によって評価されました。

ヒト骨肉腫細胞株 U2OS は、10% FBS およびペニシリン - ストレプトマイシン (Thermo Fisher Scientific) を含む DMEM (高グルコース、GlutaMAX) 中で増殖させました。

U2OS FUCCI セルは、宮脇淳氏のご厚意により提供されました14。これらの細胞は、細胞周期制御因子 CDT1 (mKO2-hCdt1+) とジェミニン (mAG-hGem+) に融合された 2 つの蛍光タンパク質で内因的にタグ付けされています。 CDT1 は G1 期に蓄積するのに対し、ジェミニンは S 期および G2 期に蓄積し、細胞周期のモニタリングを可能にします。細胞は、抗生物質を含まない 10% FBS (VWR) を補充した McCoy's 5A (改変) 培地 GlutaMAX サプリメント (Thermo Fisher Scientific、36600021) 中で、5.0% CO2 加湿環境で 37 °C で培養しました。

膜標的型の eGFP を安定して発現する U2OS 細胞は、プラスミド Lck-GFP (Addgene、61099 (参考文献 37)) でトランスフェクションし、選択培地 (10% FBS、ペニシリン - ストレプトマイシンおよび 400 μg/ml を含む DMEM 培地) で培養することによって生成されました。 −１のジェネティシン）を限界希釈条件下で単一コロニーを得る。細胞膜で均一かつ中程度の Lck-eGFP 発現レベルを持つクローン細胞株が単一コロニーから樹立されました。

すべての細胞株はマイコプラズマについてテストされ (MycoAlert、Lonza)、STR プロファイリング (IdentiCell) によって認証されました。

メンブレン PEN スライド 1.0 (Zeiss、415190-9041-000) を UV 光で 1 時間処理し、VECTABOND 試薬 (Vector Labs、SP-1800-7) を使用してメーカーのプロトコールに従って APES (3-アミノプロピルトリエトキシシラン) でコーティングしました。 FFPE 組織切片を切断し (2.5 μm)、37 °C で一晩風乾し、組織の接着を促進するために 60 °C で 20 分間加熱しました。次に、切片を脱パラフィンし、再水和し、湿った状態で全自動装置 Omnis (Dako) にロードしました。抗原賦活化は、1:10 に希釈した Target Retrieval Solution pH 9 (Dako、S2367) を使用して実施し、90 °C で 60 分間加熱しました。 EpCAM の単一染色 (Nordic BioSite、クローン BS14、BSH-7402-1、希釈 1:400) および SOX10/CD146 の連続二重染色 (SOX10、Nordic BioSite、クローン BS7、BSH-7959-1、希釈 1:200; CD146、Cell Marque、クローン EP54、AC-0052、希釈 1:400) を実行し、スライドを 30 分間インキュベートしました (32 °C)。洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、製造業者の指示に従って、EnVision FLEX、高 pH キット (Dako、GV800 および GV809/GV821) を使用して反応を検出し、視覚化しました。二重染色では、CD146 と SOX10 の可視化に、EnVision DAB (Dako、GV825) および EnVision Magenta (Dako、GV900) 基質色原体システムをそれぞれ使用しました。最後に、スライドを水ですすぎ、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、マウントせずに風乾しました。

FFPE 組織切片を切断し (2.5 μm)、コーティングされたスライド (Agilent/Dako、K8020) 上に置き、垂直に風乾した後、組織の接着を促進するために 60 °C で 20 分間加熱しました。次に、スライドを完全自動装置 Omnis にロードしました。切片を脱蝋し、Target Retrieval Solution High pH (Agilent/Dako、GV804、1:50 希釈) を使用して 97 °C で 24 分間、抗原賦活化を実施しました。続いて、切片を一次抗体とともにインキュベートしました。私たちは、委員会認定のコンサルタント病理学者によって評価および承認された抗体を選択しました。癌原遺伝子チロシンプロテインキナーゼ SRC/c-Src (Cell Signaling Technology、クローン 36D10、2109、希釈 1:3,200)、脂肪酸シンターゼ/FASN (Cell Signaling Technology、クローン C20G5、3180、希釈 1:100)、カルポニン1/CNN1 (Cell Marque、クローン EP63、AC-0060、希釈 1:300) およびサイトケラチン 5/CK5 (Leica Biosystems、クローン XM26、NCL-L-CK5、希釈 1:200) を 32 °C で 30 分間処理しました。洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、EnVision FLEX、高 pH キット (Agilent/Dako、GV800 および GV809/GV821) を製造元の指示に従って使用して、反応を検出および視覚化しました。最後に、スライドを水ですすぎ、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、カバースリップをかけました。

細胞を最初に5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)とともに20分間インキュベートし、次に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて室温で5分間固定し、PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を氷上で２分間ＰＢＳ／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで細胞をEdU標識キット(Life Technologies)で染色し、Hoechst 33342で10分間対比染色した。スライドは GB マウント (GBI Labs、E01-18) でマウントされました。

検証実験 (拡張データ図 3) では、96 ウェルガラス底プレート (Greiner SensoPlate Plus、Greiner Bio-One) を 12.5 μg ml-1 のヒトフィブロネクチン (Sigma-Aldrich) で室温で 1 時間コーティングしました。。免疫細胞化学は、確立されたプロトコールに従って実施されました38。次に、8,000 個の U2OS 細胞を各ウェルに播種し、37 °C、5% CO2 環境で 24 時間インキュベートしました。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％氷冷ＰＦＡ４０μｌで固定し、ＰＢＳ中の０．１ＴｒｉｔｏｎＸ－１００４０μｌで３×５分間透過処理した。目的のタンパク質を標的とするウサギポリクローナル HPA 抗体を、一次マーカー抗体 (下記参照) とともにブロッキングバッファー (PBS + 4% FBS) で 2 ～ 4 μg ml-1 に希釈し、4 °C で一晩インキュベートしました。細胞を PBS で 4 × 10 分間洗浄し、二次抗体 (ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 (A11034、Thermo Fisher Scientific)、ヤギ抗マウス Alexa Fluor 555 (A21424、Thermo Fisher Scientific)、およびヤギ抗ニワトリとインキュベートしました。 Alexa Fluor 647 (A21449、Thermo Fisher Scientific)) をブロッキングバッファーに溶解し、1.25 μg ml-1、室温で 90 分間使用します。細胞を0.05μg ml-1のDAPI中で15分間対比染色し、4×10分間洗浄し、PBSにマウントした。

使用した一次抗体は次のとおりです。

C7orf50 細胞周期検証の場合: 1.25 μg ml-1 のマウス抗 ANLN (amab90662、Atlas Antibodies)

マウス抗 CCNB1 1 μg ml-1 (610220、BD Biosciences)

ウサギ抗 C7orf50 1 μg ml−1 (HPA052281、Atlas Antibodies)

ヒト卵管組織の場合、FFPE 組織切片 (2.5 μm) をマウントし、上記のように前処理しました。その後、組織を１００％キシレンで２分間×２回、続いて１００％、９５％、および７０％エタノールでそれぞれ１分間、そしてｄｄＨ２Ｏ中で１分間×３回洗浄することによって脱蝋した。抗原賦活化は、EDTA賦活化緩衝液(1mM EDTA、0.05% Tween 20、pH 8.0)を使用して水浴中で95℃で1時間実施した。室温で１時間の冷却段階に続いて、ＴＢＳＴ中の１０％ヤギ血清を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。 FOXJ1 (マウス、希釈 1:200、14-9965-80、Invitrogen) および EpCAM (ウサギ、希釈 1:200、14452、Cell Signaling Technology) を標的とする一次抗体を 10% ヤギ血清で希釈し、4 °C で一晩インキュベートしました。加湿された室内で。組織標本をTBSTで5回洗浄し、FOXJ1 (Alexa Fluor 647ヤギ抗マウス、希釈1:200、A21235、Invitrogen)およびEpCAM (Alexa Fluor 555ヤギ抗ウサギ、希釈1:200、 A21428、Invitrogen）、および核可視化用のSYTO 10（10624243、Invitrogen）を暗所、室温で1時間適用しました。サンプルをTBSTで5回洗浄し、続いてTBSで2回洗浄し、ハイコンテンツイメージングのためにカバースリップをかけました。

免疫蛍光標識細胞培養の画像は、広視野光学系、×20、NA 0.8 の乾燥対物レンズ、および Hoechst、FITC、Cy3、および Cy5 用の 4 バンドフィルターセットを備えた AxioImager Z.2 顕微鏡 (Zeiss) を使用して取得しました。蛍光染料。広視野取得は、Colibri 7 LED 光源とピクセルあたり 5.86 μm の AxioCam 702 モノラルカメラを使用して実行されました。最適な焦点面を捕捉するために、19 個の Z スライスを含む Z スタックが 3 mm 刻みで取得されました。画像は、Zeiss ZEN 2.6 (ブルーエディション) を使用して、非飽和条件 (12 ビットダイナミックレンジ) で自動的に取得されました。

唾液腺および黒色腫組織からの IHC 画像は、明視野顕微鏡用の自動スライドスキャナー Zeiss Axio Scan.Z1 を使用して取得されました。明視野取得は、VIS LED 光源と CCD Hitachi HV-F202CLS カメラを使用して取得されました。 PEN スライドは、×20、0.8 NA の乾燥対物レンズでスキャンされ、ピクセルあたり 0.22 mm の解像度が得られました。最適な焦点面を捕捉するために、8 つの Z スライスを含む Z スタックが 2 mm 刻みで取得されました。カラー画像は、Zeiss ZEN 2.6 (青版) を使用して、非飽和条件 (12 ビットダイナミックレンジ) で自動的に取得されました。

LAS Xソフトウェアを使用して、0.8 NA、×40空気対物レンズおよびHamamatsu Flash 4.0 V3カメラを備えたLeica Dmi8広視野顕微鏡で細胞を画像化しました。各細胞のセグメンテーションは、核セグメンテーションに DAPI を使用する Cell Profiler ソフトウェア 8 を使用して実行されました。標的タンパク質と細胞周期マーカータンパク質の平均強度を核内で測定しました。核内の ANLN または CCNB1 強度レベルの 0.2 分位値と 0.8 分位値を使用して、細胞を細胞周期の G1 期と G2 期に分類し、G1 期間の発現レベルの差を比較することによって C7orf50 の細胞周期依存性発現を検証しました。そしてG2細胞。

細胞または核を切除するために、単一細胞自動化に適応した Leica LMD7 システムを使用しました。 HC PL FLUOTAR L ×63/0.70 (組織) または ×40/0.60 (細胞培養) CORR XT 対物レンズを使用すると、高い切断精度が達成されました。完全に自動化された切除と輪郭の収集には、Leica Laser Microdissection V 8.2.3.7603 ソフトウェア (このプロジェクトに適合) を使用しました。 FFPE 組織プロテオーム解析では、空間トランスクリプトミクス解析の推定値と一致して、サンプルあたり 50 ～ 100 個の細胞 (収集された総面積 × スライドの厚さ / 平均哺乳類細胞体積 2,000 µm3、BNID 100434) を収集しました 39。

ライカ LMD7 の切断精度 (ライカ R&D、特許 EP1276586)

×150 対物レンズの場合: \({\frac{10}{150}} = 0.07\,\upmu{\mathrm{m}}\)

nucleAIzer3 モデルは BIAS に統合され、核および細胞質セグメンテーションモデルを再トレーニングおよび改良することで、これらの実験用にカスタマイズされました。まず、style transfer5の学習を以下のように行った。免疫組織化学的に染色された黒色腫または唾液腺組織切片などの新しい実験シナリオを想定すると、その取得により、注釈付きのトレーニングデータが存在しないような画像タイプが生成され、強力な DL 手法であっても効率的なセグメンテーションが妨げられます。専門家による最初のセグメンテーションまたは手動輪郭作成 (アノテーションと呼ばれる) により、小さなマスクデータセットが取得されます (マスクは、たとえば原子核を表します)。これは、空間分布、密度が次のような新しい (合成) マスク画像を生成するために使用されます。生成されたオブジェクト (核など) の形態学的特性は、注釈付き画像で測定されたものと類似しています。初期マスクとそれに対応する顕微鏡画像は、マスク上に顕微鏡画像のテクスチャを生成する方法を学習する画像スタイル伝達モデルをトレーニングするために使用され、GANs40 (敵対的生成ネットワーク) を使用してオブジェクトをマークします。前景から原子核などを模倣します。、および周囲の組織構造などの背景。並行して、核または細胞質オブジェクトの人工マスクが作成され、画像スタイル転移学習ネットワークに入力されました。これにより、元の実験の視覚的外観を備えた現実的な外観の合成顕微鏡画像が生成されました。したがって、この人工的に作成されたトレーニングデータ (合成顕微鏡画像とそれに対応する合成マスク) を使用して、適用されるセグメンテーションモデルであるマスク R-CNN が新しい画像タイプ用に準備され、ターゲットコンパートメントを正確にセグメント化できます。

私たちは、蛍光 Lck-U2OS 細胞株、黒色腫、唾液腺、卵管の組織サンプルに対するセグメンテーションアプローチの精度をベンチマークし、結果を 2 つの DL アプローチ、unet4nuclei (図では M1 と表示) を含む 3 つの追加の方法と比較しました。 2a、S1)6、Cellpose (M3)7、および広く使用されている従来の適応しきい値ベースおよびオブジェクト分割ベースのアプリケーション (M2)8 です。 M1 は細胞質セグメンテーションを目的としていないことに注意してください (詳細は参考文献 6 以下を参照)。 F1 メトリクスに従ったセグメンテーション精度は棒グラフ (図 2b、拡張データ図 1a、表 1、補足表 1) として表示され、色分けされた視覚的表現も提供されます。

unet4nuclei6 は、細胞培養画像上の核をセグメント化するように最適化されています。 Cellpose7 は、さまざまな種類の顕微鏡画像での核または細胞質のセグメンテーションを目的としたアプローチです。 CellProfiler8 は、生体画像解析コミュニティで広く使用されている従来のしきい値ベースおよびオブジェクト分割ベースのソフトウェアです。 unet4nuclei は、その名前が示すように、主に核のセグメンテーションを目的としており、入力画像の前処理と検出されたオブジェクトの後処理の後に U-Net ベースのネットワークを使用します。 Cellpose はインスタンスのベクトルフロー表現を使用し、そのニューラルネットワーク (これも U-Net に基づく) は水平フローと垂直フローを予測して組み合わせます。 unet4nuclei は細胞培養の核セグメンテーションに適用され、成功しています。一方、Cellpose は顕微鏡以外でもさまざまな画像モダリティでうまく一般化でき、核と細胞質のセグメンテーションに使用できます。ただし、ほとんどのセグメンテーション手法と同様に、どちらも、新しく作成されたグラウンドトゥルースアノテーションを再トレーニングすることなく、特定の実験タイプ (IHC 唾液腺組織など) などの新しい画像ドメインに適応することはできません。それどころか、私たちのセグメンテーションアルゴリズム (nucleAIzer3) は、上記の画像スタイル転送アプローチを介してこれを行うことができます。明らかに、従来のアルゴリズムはどちらにも適応できません。したがって、実験ごとにパラメータを再設定する必要があります。評価のために、CellProfiler の専門ユーザーは、可能な限り最良のセグメンテーション結果が得られるようにサンプルタイプごとにパイプラインを最適化するように依頼され、サンプルタイプごとのすべての画像が 1 つのパイプライン (指定されたサンプルに対応する) でセグメント化されました。

0.7-IoU (交差オーバーユニオン) しきい値で計算された F1 スコアメトリックに従って、セグメンテーションパフォーマンス (および比較) を評価しました。 Jaccard インデックスとしても知られる IoU は、指定されたしきい値で、予測された (セグメント化された) オブジェクトとその対応するグラウンドトゥルース (実際の) オブジェクトの重複領域から計算されました (以下の公式を参照)。真陽性 (TP)、偽陽性 (FP)、および偽陰性 (FN) オブジェクトは、IoU がしきい値 t (この場合は 0.7) より大きい場合に応じてカウントされ、この時点での F1 スコアが得られます。しきい値（以下の式を参照）。セグメンテーション評価は、AnnotatorJ41 を使用して専門家によって描画されたグラウンドトゥルースアノテーションと比較して、堅牢性を示すために、各サンプルタイプ (U2OS 細胞および黒色腫、唾液腺および卵管組織) の視覚的に異なる領域からサンプリングされた 10 ～ 20 枚のランダムに選択された画像に対して実行されました。堅牢性を確保するために、各サンプルのすべての関連領域（唾液腺組織の管細胞、腺房細胞、膜染色のない細胞、リンパ球など）の画像を含めました。また、他のサンプルについても同様です。すべての可視オブジェクト (核または細胞質) の輪郭または輪郭は個別に描画され、セグメンテーションによって生成されたのと同じ形式でマスク画像にエクスポートされました (オブジェクトごとにグレーの強度が増加したインスタンスセグメンテーションマスク)。グラウンドトゥルースマスクは評価のみに使用されました。前述の画像スタイル転移学習は、新しい実験の自動的に取得されたマスクでトレーニングされました。測定された平均 F1 スコアを考慮すると、BIAS で利用可能な適用された DL ベースのセグメンテーション法 3 は、比較した方法よりも高い品質で核と細胞質の両方のレベルでセグメンテーションを生成したと結論付けます (図 2a、b の結果と拡張データ図を参照)。 1a)。

黒色腫、唾液腺および卵管上皮組織、および U2OS 細胞における核および細胞体セグメント化の評価結果を表 1 に示します。

これらの結果は、M2 や ilastik9 などの複数のセグメンテーションアプローチと比較して、さまざまな顕微鏡画像データモダリティ (蛍光細胞培養、ヘマトキシリンおよびエオシン組織、およびさらなる実験シナリオ) における nucleAIzer の優れたパフォーマンスを示した以前の研究 3 と相関しています。

CellProfiler や ilastik などの以前の方法ではセルの正確なセグメンテーションを実行できることにも注意してください。さらに、組織核セグメンテーションにおける M2 のパフォーマンスは注目に値します。一方、堅牢な方法 (DL ベースなど) では、異なるサンプルまたはタイプの画像を処理するときに、ほとんどのパラメーターをリセットする必要がないという利便性が得られます。

細胞培養物 (核または全細胞) および組織サンプルを自動 LMD によって 384 ウェルプレート (Eppendorf、0030129547) に収集しました。異なる U2OS 核クラスのコレクション (図 3 および拡張データ図 2 および 3) について、クラスごとに収集されたオブジェクトの数によって核サイズの違い (結果として総タンパク質量の違い) を正規化しました。平均して、サンプルあたり 267 個の核を収集しました。唾液腺および黒色腫の FFPE 組織サンプル (ミクロトームで切断された厚さ 2.5 μm の切片) の場合、サンプルあたり 80,000 ～ 160,000 μm2 の領域が収集され、HeLa 細胞の平均体積に基づいて推定細胞数が 100 ～ 200 個になりました。 2,000μm3 (BNID 100434)。

次に、20 μl の重炭酸アンモニウム (ABC) を各サンプルウェルに加え、プレートをシールテープ (Corning、CLS6569-100EA) で閉じました。 10 秒間ボルテックスした後、プレートを 2,000 g で 10 分間遠心分離し、サーマルサイクラー (384 ウェル反応モジュールを備えた Bio-Rad S1000) で 95 °C で 30 分間 (細胞培養) または 60 分間 (組織) 加熱しました。 110℃の一定の蓋温度で。次に、5 μl の 5×消化バッファー (100 mM ABC 中の 60% アセトニトリル) を加え、サンプルを 75 °C でさらに 30 分間加熱しました。サンプルをすぐに冷却し、1 μl の LysC を添加し (超純水で 4 ng μl-1 に事前希釈)、サーマルサイクラー内で 37 °C で 4 時間消化しました。続いて、1.5 μl のトリプシンを添加し (超純水で 4 ng μl-1 にあらかじめ希釈)、サーマルサイクラー内で 37 °C で一晩インキュベートしました。翌日、トリフルオロ酢酸 (TFA、最終濃度 1% v/v) を添加して消化を停止し、サンプルを真空乾燥しました (60 °C で約 1.5 時間)。次に、4 μl の MS ローディングバッファー (0.2% TFA 中の 3% アセトニトリル) を加え、プレートを 10 秒間ボルテックスし、2,000 g で 5 分間遠心分離しました。液体クロマトグラフィー - 質量分析 (LC-MS) 分析まで、サンプルは -20 °C で保存されました。

高 pH 逆相分別を使用して、データに依存しない MS 分析のための深い U2OS 細胞前駆体ライブラリーを生成しました (下記)。ペプチドは、スパイダーフラクショネーター 42 を使用して pH 10 で分画されました。次に、30 μg の精製ペプチドを 30 cm C18 カラムで 100 分間で分離し、90 秒の出口バルブスイッチで 12 の画分に連結しました。ペプチド画分を真空乾燥し、LC-MS 分析のために MS ローディングバッファーで再構成しました。

LC-MS 分析は、約 5 倍高いイオン電流を備えた改良型トラップイオン移動度分光法四重極飛行時間型質量分析計 (timsTOF Pro、Bruker Daltonik) に接続された EASY-nLC-1200 システム (Thermo Fisher Scientific) を使用して実行されました。 ) ナノエレクトロスプレーイオン源 (CaptiveSpray、Bruker Daltonik) を使用します。オートサンプラーは、384 ウェルプレートからサンプルをピックアップするように構成されました。

ペプチドを社内で充填した 50 cm の HPLC カラム (1.9 µm ReproSil-Pur C18-AQ シリカビーズが充填された内径 75 µm、Maisch 博士) にロードしました。

ペプチドは、5 ～ 30% 緩衝液 B (LC-MS グレードの水中の 0.1% ギ酸および 80% ACN) の直線勾配を使用して 55 分間で分離され、その後 5 分間で 60% に増加し、10 分間で分離されました。 95% バッファー B で 300 nl min-1 で洗浄します。バッファー A は、LC-MS グレードの水に 0.1% のギ酸を加えたもので構成されています。合計の勾配の長さは 70 分でした。自社製カラムオーブンを使用し、カラム温度を60℃で一定に保ちました。

質量分析は、Brunner et al.に記載されているように、データ依存型 (ddaPASEF) (図 4) またはデータ非依存型 (diaPASEF) モード (図 2、3、および 5) で実行しました。 ddaPASEF の場合、取得サイクルごとに 1 件の MS1 サーベイ TIMS-MS スキャンと 10 件の PASEF MS/MS スキャンが取得されました。デュアル TIMS 分析装置のイオン蓄積時間とランプ時間はそれぞれ 100 ms に設定され、1/K0 = 1.6 Vs cm−2 から 0.6 Vs cm−2 の範囲のイオン移動度を分析しました。 MS/MS 分析用のプリカーサーイオンは、四重極スイッチングイベントをプリカーサーと同期させることにより、合計 m/z 範囲 100 ～ 1.700 で、m/z < 700 の場合は 2-Th ウィンドウ、m/z > 700 の場合は 3-Th ウィンドウで分離されました。 TIMS デバイスからの溶出プロファイル。衝突エネルギーは、移動度の増加に応じて、1/K0 = 1.6 Vs cm-2 での 59 eV から 1/K0 = 0.6 Vs cm-2 での 20 eV まで直線的に低下しました。単一荷電の前駆体イオンは、ポリゴンフィルター (otof control、Bruker Daltonik) で除外されました。 MS/MS の前駆体は、1,000 任意単位 (au) の強度閾値で選択され、40 秒の溶出の動的除外を考慮して、20,000 au の「目標値」に達するまで再シーケンスされました。データに依存しない分析のために、イオン移動度と m/z の相関関係を利用し、各イオン移動度スキャンからの前駆体の溶出を四重極分離ウィンドウと同期させました。衝突エネルギーは、1/K0 = 1.6 Vs cm-2 での 59 eV から 1/K0 = 0.6 Vs cm-2 での 20 eV まで、イオン移動度の関数として直線的に増加しました。ライブラリの生成には ddaPASEF メソッドを使用しました。

ddaPASEF モードで取得された質量分析生ファイル (図 4) は、MaxQuant (バージョン 1.6.7.0) で分析されました 43,44。 UniProt データベース (2019 リリース、UP000005640_9606) は、ペプチドスペクトルの一致と 1% のタンパク質レベルの FDR で検索されました。可変修飾としての N 末端アセチル化とメチオニン酸化を含め、最低 7 つのアミノ酸が必要でした。還元とアルキル化が省略されたため、システインカルバミドメチル化が固定修飾から削除されました。酵素特異性はトリプシンに設定され、切断ミスは最大 2 回まで許容されました。最初および主な検索質量許容値は、それぞれ 70 ppm および 20 ppm に設定されました。 MS/MS によるペプチドの同定は、0.7 分の保持時間マッチウィンドウと 0.05 1/K0 イオン移動度ウィンドウを使用して、実行間の 4 次元同位体パターンをマッチング (MBR) することによって転送されました。ラベルフリー定量化は、MaxLFQ アルゴリズム 45 および最小比率カウント 1 を使用して実行されました。

diaPASEF 測定 (図 2、3、および 5) では、生ファイルを DIA-NN46 (バージョン 1.8) で分析しました。プロジェクト固有のスペクトルライブラリを生成するために、24 フラクションの高 pH 逆相分画前駆体ライブラリが同じ組織標本から作成され、上記のように ddaPASEF モードで取得されました。生ファイルは、デフォルト設定 (修正された変更からシステインカルバミドメチル化が削除されたことを除く) で MSFragger47 を使用して分析され、DIA-NN で使用されるライブラリファイルが生成されました。ライブラリーは、90,056 個の前駆体、79,802 個の溶出グループ、および 7,765 個のタンパク質グループで構成されていました。

プロテオミクスデータ分析は、Perseus48 を使用し、R 環境 (https://www.r-project.org/) 内で実行されました。 MaxQuant 出力テーブルは、データ分析の前に「逆」、「サイト変更によってのみ特定」、および「潜在的な汚染物質」についてフィルター処理されました。データは厳密にフィルター処理され、欠損値が 30% 以下のみ (MaxQuant 出力では 0 として表示される) のタンパク質が維持されました。欠損値は、統計検定の前に正規分布 (幅 = 0.3、ダウンシフト = 1.8) に基づいて代入されました。 PCA は R で実行されました。複数サンプル (ANOVA) またはペアワイズプロテオミクス比較 (対応のない両側 t 検定) の場合、複数の仮説検定を補正するために 5% の順列ベースの FDR を適用しました。 0.1 の s0 値 49 を、図および図のペアごとのプロテオミクス比較に使用しました。 2時間と4時間。経路濃縮分析は、Perseus (補足表 2、3、5、9; Benjamini-Hochberg FDR 0.05 によるフィッシャーの直接確率検定) または ClusterProfiler36 (補足表 7 および 10)、ReactomePA パッケージ 50、および WebGestalt 遺伝子セット分析ツールキット ( WebGestaltR)51、FDR フィルターはそれぞれ 0.05 です。カテゴリの最小サイズは 20 に設定され、最大サイズは 500 に設定されました。

顕微鏡検査と MS ベースのプロテオミクスの結果を組み合わせて視覚化するために、予測された各クラスの空間データファイルを BIAS ソフトウェアからエクスポートしました。このエクスポートでは、クラス内のセルのジオメトリと位置を含む .xml 出力ファイルが生成されます。 Python を使用してこの情報を抽出し、データフレームに集約しました。次に、各細胞の重心 (x-y 座標) を散布図にプロットし、プロテオミクスデータを重ね合わせました。空間的なコンテキストでタンパク質の機能結果を視覚化するために、生成されたプロテオミクス結果に対して REACTOME パスウェイエンリッチメント分析を実行し、特定のパスウェイの過剰表現を反映する色の勾配として正規化されたエンリッチメントスコア (Z スコア) を使用しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

質量分析プロテオミクスデータは、PRIDE パートナーリポジトリ 52 経由で、データセット識別子 PXD023904 とともに ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。 BIAS の生データ、画像の生データ、デモデータセット、BIAS をインストールして研究を再現する方法に関するオンライン資料は、European Bioinformatics Institute BioStudies データベース 53 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/) からアクセスできます。アクセッション番号S-BSST820。すべての質量分析生ファイル検索には UniProt データベース (2019 リリース、UP000005640_9606、https://www.uniprot.org) を使用しました。

高スループット機能が制限された BIAS の無料コンパイル済みバージョンは、BioStudies Archive (アクセッション番号 S-BSST820) で入手できます。これには、説明されているワークフローに適用されるすべての機能が含まれています。私たちの研究のいくつかの主要なコンポーネントは、オープンソースリポジトリで入手できます (補足表 11)。

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リファレンスをダウンロードする

著者らは、M. Rykær、J. Madsen (NNF CPR Mass Spectrometry Platform、コペンハーゲン大学)、L. Drici (NNF CPR プロテオミクスプログラム)、および技術支援についての J. Mueller (MPIB Munich) に感謝します。ライカの F. ホフマン、C. グレブ、F. シュラウドラフの技術サポートに感謝します。 T. Danka 氏と M. Kovács 氏は実りある科学的議論をしていただきました。顕微鏡サポートのために、統合顕微鏡中核施設の T. Hartig Braunstein、P. Hernandez-Varas、および C. Prats が参加しました。科学的なサポートと指導をしてくださった J. Lukas と、科学的なイラストを提供してくださった J. Percival (Illustration Ltd.) に感謝します。この研究は、ノボノルディスク財団（助成契約 NNF14CC0001 および NNF15CC0001）およびマックスプランク科学進歩協会からの助成金、および細胞周期研究の一部資金提供に対するチャンザッカーバーグイニシアチブ（助成金 CZF2019-002448）によって支援されました。 . ルンドバーグ、MM および PH。 FCは、国立研究ノード「システム医学における質量分析」（MSCoreSys）の一環として、助成契約846795（マリー・スクウォドフスカ＝キュリー助成金）とドイツ教育研究省（BMBF）に基づく欧州連合のHorizon 2020研究イノベーションプログラムを承認した。 )、助成契約 161L0222 に基づく。 BDA は、ルンドベック財団 (R252-2017-1414) およびノボノルディスク財団 (NNF20OC0065720) からの支援に感謝します。 PH、RH、FK、EM、および AK は、LENDULET-BIOMAG 助成金 (2018-342)、欧州地域開発基金 (GINOP-2.2.1-15-2017-00072)、2020 年度下期 (ERAPERMED-COMPASS、ERAPERMED-SYMMETRY) からの支援を認めています。、DiscovAIR、FAIR-CHARM）、OTKA-SNN、TKP2021-EGA09、ELKH-Excellence の助成金。 E. Lengyel は、NIH R35CA264619 および Chan Zuckerberg Initiative (CZIF2019-002435) によってサポートされています。安定した U2OS FUCCI 細胞株を提供していただいた S.ito および H.Masai (東京都医科学研究所) に感謝します。 LCK-GFP プラスミドは S. Green から贈られたものです (Addgene、プラスミド 61099)。

マックス・プランク協会が提供するオープンアクセスの資金提供。

これらの著者は同様に貢献しました: Andreas Mund、Fabian Coscia。

プロテオミクスプログラム、ノボノルディスク財団タンパク質研究センター、コペンハーゲン大学健康医科学部、コペンハーゲン、デンマーク

アンドレアス・ムント、ファビアン・コシア、アルベルト・サントス、ベアトリス・ダイリング＝アンデルセン、マティアス・マン

空間プロテオミクスグループ、ヘルムホルツ協会マックスデルブリュック分子医学センター、ベルリン、ドイツ

ファビアン・コシア

合成およびシステム生物学ユニット、生物学研究センター、エトヴェシュロラン研究ネットワーク、セゲド、ハンガリー

アンドラーシュ・クリストン、レカ・オランディ、フェレンツ・コヴァチ、エデ・マイ、ピーター・ホーバス

Single-Cell Technologies Ltd.、セゲド、ハンガリー

アンドラーシュ・クリストン、フェレンツ・コヴァチ、ピーター・ホーバス

プロテオミクスとシグナル伝達、マックス・プランク生化学研究所、マルティンスリート、ドイツ

アンドレアス＝デヴィッド・ブルナー、リサ・シュヴァイツァー、マティアス・マン

コペンハーゲン大学、健康データ科学センター、コペンハーゲン、デンマーク

アルベルト・サントス

オックスフォード大学、Li-Ka Shing Center for Health Information and Discovery、ビッグデータ研究所、オックスフォード、英国

アルベルト・サントス

デンマーク、ロスキレのジーランド大学病院病理学部

マイケル・ビゾレク、ソラヤ・ナイミ、リセ・メッテ・ラーベク＝ジェルドラム

コペンハーゲン大学臨床医学研究所、コペンハーゲン、デンマーク

リセ・メッテ・ラーベク＝ジェルドラム

デンマーク、ヘレルプのコペンハーゲン大学ヘルレフ・アンド・ゲントフテ病院皮膚科・アレルギー科

ベアトリス・ダイリング＝アンデルセン

レオ財団皮膚免疫学研究センター、コペンハーゲン大学保健医療科学部、コペンハーゲン、デンマーク

ベアトリス・ダイリング＝アンデルセン

タンパク質イメージングプラットフォーム、ノボノルディスク財団タンパク質研究センター、コペンハーゲン大学健康医科学部、コペンハーゲン、デンマーク

ユッタ・バルケッシャー & クラウディア・ルーカス

タンパク質シグナリングプログラム、ノボノルディスク財団タンパク質研究センター、コペンハーゲン大学保健医科学部、コペンハーゲン、デンマーク

クラウディア・ルーカス

米国イリノイ州シカゴのシカゴ大学産婦人科/婦人科腫瘍科

マーク・アダム・エッケルト & エルンストポーランド

スウェーデン王立工科大学、化学、バイオテクノロジー、健康における工学科学部、サイエンス・フォー・ライフ・ラボラトリー、KTH - 王立工科大学、ストックホルム、スウェーデン

クリスチャン・グナン & エマ・ランドバーグ

スタンフォード大学生物工学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

エマ・ランドバーグ

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

エマ・ランドバーグ

フィンランド分子医学研究所 (FIMM)、ヘルシンキ大学、ヘルシンキ、フィンランド

ピーター・ホーバス

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概念化: AMFC、PH、MM。方法論: AM、FC、ADB、MB、BDA、MM。ソフトウェア: RH、FK、AK、PH。調査: AM、FC、RH。正式な分析: AM、FC、RH。執筆 - 原案: AM、FC、PH、MM。執筆 - レビューおよび編集: すべての著者。リソース: すべての著者。; データキュレーション: LMRG、MB、SN、AM、FC、RH、FK、AK、AS、EM、LS、MAE、E. Lengyel および PH; 視覚化: AM、FC、AS、RH。プロジェクト管理: AM および PH。監修：MM 資金調達: FC、PH、E. Lundberg、MM

アンドレアス・ムント、ピーター・ホーバス、またはマティアス・マンへの通信。

PH は、BIAS ソフトウェアを所有および開発するバイオデータ分析会社である Single-Cell Technologies Ltd. の創設者であり株主でもあります。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biotechnology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a. 生物学的画像解析ソフトウェア (BIAS) を使用した、黒色腫、唾液腺、および卵管組織の細胞体および核のセグメント化。 F1 メトリクスを使用してセグメンテーションアプローチの精度をベンチマークし、結果を 3 つの追加の方法 M1 ～ M3 と比較しました。 unet4nuclei (M1)6、CellProfiler (M2)8、CellPose (M3)7、OUR は nucleAIzer3 を指します。バーは、SEM による平均 F1 スコア (平均の標準誤差) を示します。セグメンテーション結果の視覚的表現: 緑の領域は真陽性、青は偽陽性、赤は偽陰性に対応します。表 1 および補足表 1.b に示されているデータは、BIAS により、複数の 2D および 3D 顕微鏡画像ファイル形式の処理を可能にします。画像の前処理、深層学習ベースの画像セグメンテーション、特徴抽出、機械学習ベースの表現型分類の例。 c、左：卵管上皮細胞のレーザー顕微解剖前のLMD7ソフトウェアでの輪郭位置合わせ。中央: レーザー顕微解剖後のスクリーンショット。右: 個々の卵管上皮細胞におけるレーザー顕微解剖後の 384 ウェル検査。 d、FOXJ1陽性および陰性上皮細胞の複製ごとの定量化されたタンパク質の数。サンプルはデータ独立モードで取得され、DIA-NN ソフトウェアで分析されました。 e, プロテオーム測定の相関関係を再現します。相関値はピアソン相関を示します。 f、分泌性卵管上皮細胞と比較して、繊毛細胞において有意に高いタンパク質の経路濃縮分析。

a、細胞全体と核の複製の定量的プロテオミクス結果、および細胞全体と核の間の比較。 b、全細胞（n = 3）および核プロテオーム（n = 3）の主成分分析（PCA）。 PC1 への寄与が最も強いタンパク質が強調表示されます。 c, 6 つの核クラスの相対的な割合。 d、未分類の核（バルク）と比較した、差次的に発現されたタンパク質の数（両側t検定、n = 3の生物学的複製）。 FDR が 0.05 未満のタンパク質は重要であるとみなされました。 e、核クラスごとの有意に調節されたタンパク質の数と相対クラス比率との相関。線形モデルをデータに当てはめると、ピアソン r = -0.96 (p 値 = 0.01) の逆相関が示されました。 f、5 つの核クラスにわたる既知の細胞周期マーカーの相対タンパク質レベル (Z スコア)。すべての棒グラフはデータの平均 (n = 3 の生物学的複製) を表し、誤差バーは標準分散分析 (SD ANOVA) の p 値を示します。

a、ML によって特定された 6 つの核クラスの核面積をピクセルで示すヴァイオリンプロット。 b、細胞周期擬似時間との関係における、U2OS FUCCI 細胞のピクセル単位の核面積。カラーコードは点密度を示します。 c、蛍光タグ付きCDT1およびGMNN強度およびガウスクラスタリングによって決定された3つの主要な細胞周期状態G1、G1/SおよびS/G2の核領域。箱ひげ図は、合計 n = 238,675 セルの結果を示します (G1 では 85,551、G1/S では 83,121、S/G2 では 70,003)。 d, データセット内のすべての同定された ORF タンパク質の相対タンパク質レベル。 C7orf50、C1orf112、C19orf53、および C11orf98 は、5 つの核クラスにわたって差次的に発現されました (ANOVA p 値 < 0.05) (n = 3 生物学的複製)。 e、U20S細胞における免疫蛍光染色されたC7orf50および細胞周期マーカーANLNおよびCCNB1の平均強度。 C7orf50 レベルは、ANLN および CNNB1 強度が低いおよび高い核で定量されました。箱ひげ図は、条件あたり n = 263 セル (C7orf50-ANLN) および条件あたり n = 412 セル (C7orf50-CCNB1) の結果を示します。 f、上のパネル: C7orf50 および DNA (DAPI) で染色された U2OS 細胞の代表的な免疫蛍光画像 19。スケールバーは20μmです。 C7orf50 には核小体が豊富に含まれていることに注意してください。下のパネル: C7orf50 で染色された膵臓腺癌の免疫組織化学 (https://bit.ly/2X4re05)。画像クレジット: Human Protein Atlas。スケールバーは40μmです。 g、相対 C7orf50 RNA レベル (FPKM、100 万リードあたりのエクソンのキロベースあたりのフラグメント数) に基づく膵臓腺癌のカプランマイヤー生存分析 (https://bit.ly/3BAxewA)。 RNA-seq データは、The Cancer Genome Atlas (https://bit.ly/3iSOG8d) によって生成された FPKM 中央値として報告されます。患者は、C7orf50 レベルに基づいて 2 つのグループに分けられ、低患者 n=41、高患者 n=135 でした。ログランク検定は p = 0.0001 で計算されました。 h、C7orf50の文字列インタラクトーム分析。 color54 で強調表示された 5 つの最も近いインタラクターを使用して、0.7 という高い信頼スコアが使用されました。 c と e の箱ひげ図は、データの範囲 (ひげ)、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル (箱)、および中央値 (実線) を定義します。外れ値は、ひげの外側に個々の点としてプロットされます。

a、細胞接着タンパク質EpCAMについて染色された正常な唾液腺の免疫組織化学的染色。教師付き (ランダムフォレスト) ML は、腺房細胞 (緑色) と管細胞 (青緑色) を識別するようにトレーニングされました。スケールバー = 20μm。 b. 既知の細胞型特異的マーカーを強調表示した、A の組織由来の腺房細胞と管細胞間の定量的プロテオミクス比較 (https://bit.ly/3iOK8Qf)。 c、腺房細胞または管細胞で有意に高かった、選択された経路の相対タンパク質レベル。 d、2人の異なる患者からの腺房細胞および管細胞プロテオームと腺房細胞癌細胞の教師なし階層クラスタリング。 2 つの異なる組織の正常な腺房細胞がクラスター化していることに注目してください。管細胞は最も遠くに集まっています。クラスタリングの前に、さまざまなサンプルグループ (管細胞組織 #1、腺房細胞組織 #1、腺房細胞組織 #2、癌組織 #2) からのタンパク質レベルを平均し、Z スコアを付けました。左側のバーは、パネル b からの差次的に発現された経路を示し、腺房および管特異的タンパク質がそれぞれ緑色と青緑色で示されています。

a、皮膚黒色腫組織からの腫瘍に隣接するSOX10陽性メラノサイトの単離。左: レーザー顕微解剖前の輪郭の位置合わせ。右: レーザー顕微解剖後の検査。 b、n = 4 (メラノサイト)、n = 5 (間質)、n = 5 (黒色腫 in situ)、および n = 13 (黒色腫) の独立した複製を使用したサンプルタイプごとのタンパク質定量の数。棒グラフはデータの平均を表し、誤差バーは標準偏差です。サンプルはデータ独立モードで取得され、DIA-NN ソフトウェアで分析されました。 c、上のパネル：同定されたタンパク質クラスターとともに示された図5hのヒートマップ（カラーバー）。 1,910 のすべての ANOVA 有意 (FDR < 0.05) タンパク質グループに基づく教師なし階層クラスタリング。タンパク質レベルを Z スコアで評価しました。下のパネル: 教師なし階層クラスタリングによって取得されたさまざまな行クラスターのパスウェイエンリッチメント分析。 ReactomePA パッケージは、すべてのエンリッチされた用語に対して 0.05 の FDR カットオフでエンリッチメント分析に使用されました。 d、KEGG用語「メラニン生成」に関連するタンパク質の相対レベル（Zスコア）。メラノサイトは最高のタンパク質レベルを示すことに注意してください。箱ひげ図は、データの範囲 (ひげ)、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル (箱)、および中央値 (実線) を定義します。外れ値は、ひげの外側に個々の点としてプロットされます。 e、垂直成長黒色腫細胞と放射状成長黒色腫細胞において上方制御または下方制御されるタンパク質の経路濃縮分析。強化の結果は、FDR < 0.05 に基づいて ClusterProfiler R パッケージ 36 を使用して得られました。

バイアス情報

自動化された LMD 単核分離

自動化された LMD 単一セル分離

F1 メトリクスを使用したセグメンテーションアプローチの精度のベンチマークと 3 つの追加手法との結果の比較

Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 によるフィッシャーの直接確率検定に基づく、分泌性卵管上皮細胞と比較して繊毛細胞で有意に高いタンパク質の経路濃縮解析

Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 によるフィッシャーの直接確率検定に基づく、核クラス間で差次的に制御されるタンパク質のパスウェイ濃縮解析の結果

順列ベースの FDR < 0.05 による ANOVA 分析に基づく、核クラス間でタンパク質の制御が異なっている

Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 の両側 (2 サンプル) Wilcoxon-Mann-Whitney 検定に基づく、健康な唾液腺の腺房細胞と管細胞の間で差次的に調節されるタンパク質のパスウェイエンリッチメント解析結果

腺房細胞癌と正常な腺房細胞の間でタンパク質は異なって調節されています。両側 t 検定は順列ベースの FDR < 0.05 で実行されました。

in situ 黒色腫と原発性黒色腫の Reactome Pathways (ReactomePA) の遺伝子セット濃縮分析。 FDR 調整後の P 値が <0.05 の経路が表示されます。

順列ベースの FDR < 0.05 による ANOVA 分析に基づいて、原発性黒色腫のすべての細胞クラス間でタンパク質が異なって制御される

Benjamini-Hochberg FDR < 0.05でのフィッシャーの直接確率検定に基づく、図5iの2つの強調表示されたヒートマップクラスター内のタンパク質のパスウェイエンリッチメント分析結果

垂直成長期と放射状成長期の黒色腫細胞に対する Reactome Pathways (ReactomePA) の遺伝子セット濃縮分析。 FDR 調整後の P 値が <0.05 の経路が表示されます。

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転載と許可

Mund, A.、Coscia, F.、Kriston, A. 他。 Deep Visual Proteomics は、単一細胞の同一性と不均一性を定義します。 Nat Biotechnol 40、1231–1240 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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受信日: 2022 年 3 月 8 日

受理日: 2022 年 3 月 30 日

公開日: 2022 年 5 月 19 日

発行日：2022年8月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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